Принцип выделения ДНК с помощью Diamond DNA
Метод выделения ДНК из тканей растительного и животного происхождения и их дериватов с помощью Diamond DNA основывается на лизисе тканей в лизирующем буфере, сорбции ингибиторов ферментативных реакций из раствора и осаждении ДНК из раствора с помощью изопропанола или специально разработанного буфера для осаждения ДНК.
Принципиальная простота и низкая продолжительность процесса выделения и очистки ДНК достигается применением селективного сорбента, являющегося продуктом разработки оборонных предприятий. Применяется высокоэффективная селективная адсорбция примесей, обеспечивающая в результате уникальные показатели чистоты ДНК (OD260/OD280 не менее 1,8). Примеси протеинов в очищенной ДНК невозможно идентифицировать с помощью методов дифференциального окрашивания и последующей флуориметрии, при этом потери ДНК после стадии очитки составляют не более 10 %. При использовании Diamond DNA достигается высокая степень очистки от таких сильных ингибиторов ПЦР как полифенолы и полисахариды. Содержание ДНК в растворе после очистки прямо пропорционально содержанию нуклеиновых кислот в исходном объекте, что повышает достоверность при использовании количественных методов анализа (RealTime-ПЦР и детекции по конечной точке).
В отличие от широко используемых методов и наборов, основанных на сорбции молекул ДНК на частицах оксида кремния (в виде суспензии или микроколоночном исполнении) очистка ДНК с использованием набора Diamond DNA исключает сильную деградацию молекул нуклеиновых кислот. В результате длина фрагментов составляет более 20000 пар нуклеотидов.
Использование дополнительной стадии осаждения примесей позволяет еще более повысить качество очистки.
Рис. 1. Тотальная ДНК из эквивалентных количеств растительной ткани (Allium sp.), выделенная с помощью разных методов (электрофорез в 0,5% агарозном геле).
Дорожки:
1 – маркер молекулярного веса (ДНК фага лямбда после обработки EcoRI и HindIII);
2 – маркер молекулярного веса (1Kb);
3 – ДНК выделенная с помощью Diamond DNA;
4 – ДНК выделенная с помощью микроколоночного метода;
5 – ДНК выделенная с помощью сорбции на SiO2;
6 – ДНК выделенная с помощью CTAB-метода.
В процессе использования Diamond DNA отсутствует непосредственное взаимодействие молекул ДНК с сорбентом, что позволяет сохранить целостность двойной спирали. Случайное попадание сорбента в ПЦР-смесь не блокирует амплификацию.
Выделенная с помощью Diamond DNA ДНК пригодна для дальнейшего гибридизационного анализа, постановки ПЦР и секвенирования.
Рис. 2. Фрагмент сиквенса протяженного участка ядерной ДНК, выделенной с помощью Diamond DNA.
ДНК, выделенная с помощью Diamond DNA, имеет длительный срок хранения (более 1 года при - 20ºС) без значимого разрушения и изменения структуры.