Выделение ДНК из крови (Корниенко и др., 2001)
Гуанидинизотиоционат является очень сильным денатурирующим агентом, который используется для одновременного лизиса клеток и денатурации всех клеточных белков. В основе метода лежит лизис клеток крови и сорбция молекул ДНК на сорбенте SiO2. После промывки от примесей ДНК смывается с частиц сорбента водой или ТЕ-буфером. Данный подход используется в большинстве отечественных наборов для выделения ДНК из крови. ДНК получается высокой степени очистки и малыми потерями, но сильно фрагментированная. Также частицы SiO2, попавшие в выделенную ДНК могут ингибировать ПЦР.
Внимание! При взаимодействии гуанидинизотиоционата с кислотами образуется токсичная синильная кислота. Все отработанные растворы необходимо сливать в емкость с 1-10М щелочью (KOH, NaOH) для нейтрализации.
Необходимые реагенты:
ЛБГ: 120 г гуанинтиоционата растворить в 100 мл 0,1 М Tris-НСl, рН 6,4; добавить 22 мл 0,2 М раствора ЭДТА и 2,6 г Triton Х-100. Раствор гомогенизировать.
ОРГ: 120 г гуанинтиоционата растворяют в 100 мл 0,1 М Tris-НСl, рН 6,4. Растворение ускорить подогреванием до 60-65°C при перемешивании.
ЭБ: Растворить 1,21 г Tris-НСl в 60 мл воды, добавить 2 мл 0,5 М раствора ЭДТА рН 8,0. Концентрированной соляной кислотой довести рН до 8,0. Довести объем раствора до 1 л.
Автоклавировать при + 121°С в течение 20 минут.
Сорбент SiО2: 60 г двуокиси кремния (Sigma, 0,5-10 микрон) суспендировать в 500 мл дистиллированной воды в стеклянном цилиндре и оставить на 24 часа при комнатной температуре. Отобрать 440 мл супернатанта и довести объем до 500 мл дистиллированной водой. Энергично встряхнуть для перемешивания и оставить на 5 часов при комнатной температуре. Удалить 440 мл супернатанта и добавить 600 мкл НСl (32%, w/v), чтобы рН сделать равным 2. Полученного количества суспензии сорбента достаточно приблизительно на 1500 экстракций нуклеиновых кислот. Суспензию распределить по 4 мл в стеклянные флаконы с плотно закрывающимися пробками и автоклавировать 20 минут при +121°С. Сорбент стабилен в течение 6 месяцев при комнатной температуре в темноте.
1. В стерильную пробирку типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл внести 900 мкл лизирующего буфера с гуанидинтиоционатом (ЛБГ) и 100 мкл крови.
3. Добавить 40 мкл суспензии сорбента SiO2 (перед использованием встряхнуть на вортексе), 5 секунд встряхивать на вортексе.
4. Термостатировать при +56°С в течение 15-30 мин.
5. В течение 5 секунд встряхивать на вортексе, центрифугировать 15 секунд при 10000-15000 об./мин.
6. Супернатант удалить в сосуд с 10 М NaOH (не допускать разбавления щелочи ниже 0,3 М), тем самым нейтрализуя синильную кислоту, образующуюся при контакте гуанидинтиоционата с кислотами.
7. К осадку сорбента добавить 0,8-1 мл отмывающего раствора с гуанидинтиоционатом (ОРГ). Встряхнуть на вортексе.
8. Центрифугировать 15 секунд при 10000-15000 об./мин.
9. Супернатант удалить сосуд с NaOH.
10. пп. 7-9 повторить еще раз.
11. К осадку сорбента добавить 0,8-1 мл 70% водного раствора этанола. Встряхнуть на вортексе.
12. Центрифугировать 15 секунд при 10000-15000 об./мин.
13. Супернатант удалить сосуд с NaOH.
14. ПП. 11-13 повторить еще раз.
15. К осадку сорбента добавить 0,8-1 мл ацетона. Встряхнуть на вортексе.
16. Центрифугировать 15 секунд при 10000-15000 об./мин. Супернатант удалить.
17. После удаления ацетона пробирки с открытыми крышками поместить в термостат на + 56°С.
18. Инкубировать в течение 10 минут.
19. К осадку сорбента добавить 50-75 мкл элюирующего буфера (ЭБ). Встряхнуть на вортексе.
20. Инкубировать при температуре +56°С в течение 10 минут.
21. Встряхнуть на вортексе.
22. Центрифугировать 2 минуты при 10000-15000 об./мин. Супернатант содержит ДНК, переносится в новую пробирку и пригоден для постановки ПЦР.