СТАВ-метод выделения ДНК из растений (Doyle and Doyle, 1987)

В основе метода лежит лизис клеток буфером на основе СТАВ (ЦТАБ –цетилтриметиламмонийбромид, входит в состав многих бытовых моющих средств), депротинизация хлороформом и осаждение ДНК изопропанолом.

Внимание! Хлороформ – сильный канцероген, может вызывать нарушения работы центральной нервной системы. Работать необходимо в хорошо проветриваемом помещении под вытяжкой.

Необходимые реагенты:

СТАВ-буфер: 2% СТАВ(10,0 г), 1,4 M NaCI (40,91 г), 20 мM ЭДТА (20 мл 0,5 M ЭДТА), 100 мM Tris-HCI pH 8 (50 мл 1М Tris-HCI) добавить дистиллированную воду до конечного объёма 500 мл.

ТЕ-буфер: 10 мM Tris-НС1, рН 8,0; 1 мM ЭДТА. Хранить при 2-8°С.

1. Примерно 2 см2 листьев положить в 1,5 мл пробирку. (Можно положить лист на пробирку и надавливанием крышки выдавить два-три круга).

2. Добавить 400 мкл СТАВ 2%-буфера и быстро, в течение 30 сек., измельчить с помощью палочки-измельчителя.

3. Добавить 10 мкл РНКазы и 5 сек. встряхнуть на встряхивателе.

4. Инкубировать 60-80 мин при 65°С на водяной бане или сухом нагревателе, периодически аккуратно взбалтывать.

5. Добавить 400 мл очистительного раствора хлороформ-изоамиловый спирт (очистительный раствор: 92% хлороформа и 8% изоамилового спирта).

6. Центрифугировать 1 мин при максимальной скорости (13000 об/мин).

7. Осторожно пипеткой отобрать верхнюю фазу (постараться не захватить промежуточную пленку) и перенести в новую пробирку.

8. Повторить пункты 5-7.

9. Добавить 350 мл холодного изопропанола и тщательно перемешать растворы не допуская энергичного встряхивания.

10. Центрифугировать 10 мин при максимальной скорости (13000 об/мин).

11. Изопропанол акуратно слить и осажденную ДНК прополоскать в 70% этаноле.

12. Центрифугировать 5 мин при максимальной скорости (13000 об/мин).

13. Спирт слить и ДНК оставить в открытой пробирке для сушки (часто достаточно около 1 часа).

14. Высохшую ДНК растворить в дистилированной воде или для долгого хранения ДНК лучше растворить в ТЕ-буфере.