Выделение ДНК из тканей животных (Hills et al., 1990)
Данный метод используется для выделения высокомолекулярной ДНК. В основе метода лежит лизис клеток SDS (додецилсульфат натрия, входит в состав многих бытовых моющих средств и зубной пасты), депротеинизация фенолом и хлороформом и осаждение ДНК спиртом.
Внимание! Фенол является ядовитым веществом, оставляющим ожоги на коже. Хлороформ – сильный канцероген, может вызывать нарушения работы центральной нервной системы. Работать необходимо в хорошо проветриваемом помещении под вытяжкой.
Необходимые реагенты:
STE-буфер: 0,1М NaCl; 0,1М Tris-HCl (рН 7,5); 0,001M ЭДТА, стерилизовать автоклавированием (20 мин. при 121°С).
PCl: смесь фенол-хлороформ-изоамиловый спирт в пропорции 25:24:1. Фенол предварительно перегнать под воду и довести рН до 7,1-7,5 добавлением ТЕ-буфера
Cl: смесь хлороформ-изоамиловый спирт в пропорции 24:1.
ТЕ-буфер: 0,001М Tris-HCl (рН 7,5); 0,001M ЭДТА
Предварительно растереть ткань в жидком азоте в фарфоровой ступке.
1. Перенести 100 мг пробы в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку (Eppendorf), прилить 500 мкл STE-буфера.
2. Добавить 25 мкл протеиназы К (10 мг/мл рабочего раствора) и 25 мкл SDS (20% водный раствор), ресуспендировать пробу.
3. Инкубировать 1-2 часа при 55°С, периодически переворачивать пробирку для перемешивания пробы.
4. Добавить 500 мкл PCl, перемешивать до образования однородной эмульсии (не допускается энергичное встряхивание во избежание механического разрушения ДНК).
5. Центрифугировать 5 мин при 7000 g.
6. Верхнюю фазу перенести в чистую 1,5 мл пробирку, стараясь не захватывать интерфазу.
7. Повторить ПП. 4-6.
8. Добавить 500 мкл Cl, перемешивать до образования однородной эмульсии (не допускается энергичное встряхивание во избежание механического разрушения ДНК).
9. Центрифугировать 3 мин при 7000 g.
10. Верхнюю фазу перенести в чистую 1,5 мл пробирку, стараясь не захватывать интерфазу.
11. Повторить ПП. 8-10.
12. Добавить 45 мкл 2М NaCl или 3M NaAc и 1 мл 96% этанола, премешать переворачивая пробирку.
13. Инкубировать в морозильной камере при -16 (-20)°С 10-20 минут.
14. Центрифугировать 1-2 мин при 7000 g, супернатант удалить.
15. Просушить осадок от спирта в вакуумной центрифуге или при комнатной температуре (открыв крышку пробирки) до исчезновения запаха спирта (примерно 20 мин.).
16. Растворить осадок в 100 мкл деионизированной воды или ТЕ-буфера.